在无标记定量蛋白质组学（Label-Free Quantitative Proteomics, LFQ）中，数据归一化（Normalization）是确保不同样本间可比性和降低技术偏差的关键步骤。如果不进行有效的归一化处理，技术噪音（如上样量差异、仪器漂移）可能掩盖真实的生物学变化，导致差异蛋白的识别出现偏差。

一、为什么需要对无标记定量蛋白质组学数据进行归一化？

无标记定量蛋白质组学依赖于肽段或蛋白在质谱中检测到的信号强度（通常是峰面积或MS1强度）来进行相对定量。然而，在实际样本处理和质谱分析过程中，可能引入以下偏倚因素：

• 上样总量差异
• LC-MS系统的运行状态变化（如柱效下降）
• 离子化效率差异
• 数据采集时间的批次效应（Batch Effect）

归一化的目的是消除这些非生物学差异，确保样本间的蛋白表达量是具有可比性的。

二、无标记定量常用的归一化方法

针对无标记定量蛋白质组学数据的归一化策略可分为以下几类，每类都有其适用情境和优劣点：

1、总离子流归一化（Total Ion Current, TIC）

（1）原理：将每个样本的总信号强度归一为相同数值（如1或平均值），再对单个蛋白信号进行缩放。

（2）优点：简单快速，适用于整体蛋白表达差异不大、样本量较均衡的项目。

（3）局限：对极端样本（如肿瘤组织 vs 正常组织）可能失效，因其总蛋白表达本身就有系统性差异。

2、中位数归一化（Median Normalization）

（1）原理：将每个样本蛋白表达值的中位数校正为统一水平。

（2）优点：对极端值不敏感，适合存在少量高丰度蛋白变化的情境。

（3）局限：假设大部分蛋白在各样本中无显著表达差异。

3、分位数归一化（Quantile Normalization）

（1）原理：使所有样本的蛋白表达值分布曲线一致。

（2）优点：在转录组数据中广泛应用，适合大样本、多组比较。

（3）局限：可能过度扭曲真实的表达变化，尤其是在生物差异显著的样本中。

4、基于参考蛋白或内参归一化

（1）原理：选择表达稳定的蛋白作为内参，按其表达水平校正其他蛋白。

（2）优点：更贴近真实生物状态。

（3）挑战：需先筛选稳定表达的蛋白，或者引入外源标准蛋白（spike-in）。

5、LFQ intensity归一化（MaxQuant特有）

（1）原理：MaxQuant中的LFQ intensity已内置归一化逻辑，包括对识别肽段数量、MS1强度等因素的多层校正。

（2）适用情景：使用MaxQuant处理数据时推荐保留其默认归一化结果。

三、如何选择合适的无标记定量蛋白质组学数据归一化方法？

百泰派克生物科技建议：

在实际无标记定量蛋白质组学项目中，我们会依据样本类型、实验设计以及客户研究目标，动态调整归一化策略。例如：

• 肿瘤样本 vs 正常组织 → 倾向采用中位数归一化或MaxQuant LFQ强度
• 时序样本或处理梯度样本 → 可使用TIC+内参双重归一化
• 高通量样本批次分析 → 引入QC样本标准化 + 批次效应校正

四、归一化后的质量评估：哪些指标值得关注？

仅完成归一化还不够，归一化效果的评估是确保数据可靠性的重要环节：

常用的QC评估方式包括：

• 箱线图/密度图：查看样本间整体分布是否一致
• PCA图（主成分分析）：样本是否按组聚类、批次是否明显
• CV分布（变异系数）：归一化后，技术重复的CV是否降低
• 热图：查看归一化是否改善了差异蛋白的识别清晰度

在无标记定量蛋白质组学中，归一化不是一个可有可无的步骤，而是决定数据可信度的核心流程。选择合适的归一化策略，并结合质量评估，才能真正还原样本间的真实生物差异。百泰派克生物科技拥有多年蛋白组数据处理经验，结合自动化分析流程与人工质量控制，为客户提供高覆盖、高重复性、可溯源的蛋白质组定量数据。如果您在归一化策略选择、批次效应处理或差异分析中遇到挑战，欢迎联系我们的专家团队，获取个性化建议与技术支持。

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百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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